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高效液相色谱法检测花生中的黄曲霉毒素

发表时间:2019-07-04 11:39

一、黄曲霉毒素

1、黄曲霉毒素及来源

黄曲霉毒素:是一组真菌(霉菌)毒素。黄曲霉毒素是一类化学结构类似的化合物,均为二氢呋喃香豆素的衍生物。主要有黄曲霉寄生曲霉产生的次生代谢物。

来源:存在于土壤、动物、植物、各种坚果里。特别是花生、大豆、荞麦、酱豆很容易被污染。                           

2、理化性质及毒性

它是目前自然界中已经发现的理化性质最稳定的一类真菌毒素,具有很强的毒性、致癌性、致突变性和致畸毒性。其中以黄曲霉毒素B1的毒性最大,相当氰化钾的10倍, 砒霜的68倍,且其致癌性是二甲基亚硝胺的70倍。在水中很难溶解,可以溶解在油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂,但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性溶液中比较稳定,在强酸性溶液中稍有分解,可以在PH9-10的强碱溶液中分解迅速,其纯品为无色结晶,耐高温。

二、检测方法选择

我国很早之前就已经对黄曲霉毒素展开研究,制定了一系列相应检测标准。目前国标方法已有12种之多,其中包括薄层分析法,液相色谱法,酶联免疫法,毛细管电泳法,荧光光度法,金标试纸法和生物传感器法。液相色谱法中高效液相色谱法是目前国内外比较权威的定量检测黄曲霉的分析方法,也是我国黄曲霉毒素检测的国家标准方法。所以在检测时选用了高效液相色谱-柱后光化学衍生法。

三、高效液相色谱仪

1、原理

样品溶液经进样器进入流动相,随着流动相进入色谱柱,由于样本溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的“吸附-解吸”的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样本浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式输出检测结果。

2、组成

高压输液系统、进样系统、分离系统(色谱柱)、检测系统、数据处理和记录系统。

3、特点

高效液相色谱与经典液相色谱相比有以下优点:分析速度快、分辨率高、检测灵敏度高、色谱柱可反复使用、样品量少,容易回收。

四、实验过程

1、样品前处理

样液准备:将均质杯放在天平上,在其内分别称取25g花生四份。再称取5gNaCl加入均质杯中。最后用200mL量筒量取125mL甲醇-水溶液(700+300)加入均质杯内。在其中两份两份花生中分别加入50μL(1μg/mL)标准品溶液作为回收。将盛有样品的均质杯依次放在均质器上进行打磨混匀。将定性滤纸两张叠放在玻璃漏斗上,下端接入锥形瓶内,先在滤纸上倒入少量样品过滤润洗锥形瓶,润洗后正式开始过滤。过滤完成后取滤液15mL分别倒入100mL量筒中再加入30mL超纯水震荡混匀。

样液的净化:在过滤的同时激活免疫亲和柱,将免疫亲和柱安装好加入10mL超纯水进行激活,速度控制在大约1s滴1滴。激活完成后将混合好的样液经过两张玻璃滤纸过滤15mL到已经激活的免疫亲和柱中,混合样液完全从亲和柱中过滤后,再在免疫亲和柱中加入10mL超纯水。

样液洗脱:在亲和柱中加入1mL甲醇,用洗耳球吹洗,速度控制在1滴/秒,甲醇全部通过亲和柱后再加入1mL超纯水,吹洗速度与甲醇的保持一致。

样液装瓶:把洗脱下来的液体放在涡旋混合器上,震荡混匀后取1000μL装入进样瓶,在进样瓶上注明名称以及日期。配制1ng/mL的标准品1000μL放入进样瓶混匀,再配制一个空白(1000μL甲醇-水溶液)。

备注:实验所用药品氯化钠(NaCl)为优级纯、甲醇(CH3OH)为色谱纯,水为超纯水。混合标准品为国标GB5009. 22 — 2016中规定标样。

2、实验参数

以C18柱为分离色谱柱,甲醇-水(45:55,体积:体积)溶液为流动相梯度洗脱,流速1mL/min,在室温下,激发波长360nm,发射波长435nm条件下,进样量20μL,经过光化学衍生后用荧光检测器检测。

3、进样检测

①先换流动相(A:甲醇-45% B:水-55%)

②再打开电脑和仪器

③打开联机软件

④进样针变绿后再打开泵和温控箱,将流动相容量修改为相应的体积,再将流速改为3mL/min,打开空气阀排净气泡,再把空气阀关闭流速改为1mL/min,冲柱一段时间。           

⑤将进样瓶放入指定位置(依次为空白、标准品、样品、回收)

⑥建立序列,修改子目录(将日期设为子目录),修改完毕点击样品位置修改名称、坐标,查看进样次数,确定进样量(20μL)。

⑦打开FLD,同时打开荧光检测器,和光化学衍生器,待准备就绪后点击开始。

⑧检测完毕后,打开结果查看峰,有杂峰影响时点击删除杂峰,然后点击校正,删除校正。

4、实验数据

黄曲霉毒素G2在8.1分钟左右出现峰,黄曲霉毒素G1在9.6分钟左右出现峰,黄曲霉毒素B2在11.7分钟左右出现峰,黄曲霉毒素B1在14.3分钟左右出现峰,若在其他时间段出现峰则不属于黄曲霉毒素的峰。四种黄曲霉毒素峰宽在0.3~0.4min,而峰高和峰面积中则是B2较大,G1较小,B1和G2属于居中。

回收率=样品峰高/标准品的峰高

70%≤回收率≤120%视为未检出黄曲霉毒素。

①标准品


②花生回收1

③花生回收2

结果计算

5、结果与讨论

在此实验中使用高效液相色谱检测黄曲霉毒素一般分为:提取、净化、衍生和测定,但因文中采用了无衍生器法,所以此实验无衍生那一步骤。提取采用了甲醇水溶液和氯化钠固体,净化采用了免疫亲和柱(IAC),测定时流动相为甲醇水45:55,用荧光检测器检测在激发波长为365nm,发射波长为450nm下检测20μL样品。结果表明:在此方法中黄曲霉毒素回收率在70%~120%之间,选用样品中均无黄曲霉毒素。

黄曲霉毒素存在范围极广难以防范,国家对黄曲霉检测制定了相应的标准。但我们在日常生活中不可能将所有所需所用都进行检测,但我们可以通过一些方法在日常生活中进行辨别:如不建议摄入发霉食物,也可以通过在低温、干燥、避免阳光直射的地方存放食物;关注食品的保质期等方式减少食物被黄曲霉毒素污染的风险。

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